技術情報

MonoFas®口腔粘膜細胞ゲノムDNA抽出キットⅧ プロトコル

必要な試薬及び器具

  • MonoFas口腔粘膜細胞ゲノムDNA抽出キットⅧ
  • Proteinase K (20mg/mL)
  • イソプロパノール(特級)
  • 1.5mL遠心チューブ
  • 高速マイクロ遠心機(20,000 × g(15,000 rpm)の遠心が可能なもの)
  • ドライバスと1.5mLチューブ用ヒートブロックまたはウォーターバス(70℃で使用可能なもの)
  • ボルテックスミキサー(2500 rpm 程度の攪拌ができるもの)
  • マイクロピペット、マイクロピペット用チップ

*:遠心機によっては使用できないケースがありますので、遠心機の仕様をご確認の上、使用してください。

口腔粘膜細胞ゲノムDNA抽出 プロトコル

MonoFas口腔粘膜細胞ゲノムDNA抽出キットⅦプロトコルの画像

プロトコル詳細及び注意事項

  • 工程①
    • 新鮮または凍結口腔粘膜細胞を準備する。先ず1.5mLのチューブに滅菌水1mLを入れて、適当な口腔粘膜細胞を綿棒で採取、綿棒をチューブに浸して懸濁する。
  • 工程②
    • 上清を捨て、沈殿に200µLのBuffer A8を加えて懸濁(ボルテックス)する。Buffer A8に析出が見られる場合は、約40℃で再溶解した後に使用する。
  • 工程③
    • 10µLの20mg/mL Proteinase Kを加えて、懸濁後(ボルテックス)、70℃で10分間反応させる。
    • 注)口腔粘膜細胞量が多すぎた場合、カラムの目詰まり、回収量減少、精度低下の可能性があります。目詰まりした場合は、口腔粘膜細胞量を減らして検討してください。また口腔粘膜細胞の量が多い場合はBuffer A8の量を200µLから400µLに変更、もしくはBuffer B8の量を200µLから400µLに変更してください。
    • 注)口腔粘膜細胞を採取綿棒に採った後、できるだけ-20℃または-80℃で保存することを推奨します。 凍結口腔粘膜細胞を使用する場合は、室温にしてから直ちに Buffer A8を加えてください。新鮮な口腔粘膜細胞を使用する場合は、所定量の口腔粘膜細胞へBuffer A8を加えてください。70℃にて攪拌しながら、口腔粘膜細胞を完全に溶解させる。加温できるシェーカーなどで攪拌してください。または、加温しながら時々ボルテックスして口腔粘膜細胞をよく溶解してください。溶解しにくい場合は、時間を延長してください。
  • 工程④
    • サンプル液に200µLのBuffer B8を添加し、ボルテックスして混和する。
    • 注)Buffer B8の混和がボルテックスで不十分なときは、タッピング、ピペッティングあるいは転倒混和などでよく混ぜてください。
  • 工程⑤
    • 特級イソプロパノールを200µL添加し、ボルテックスして混和する。数秒間スピンダウンして、キャップや壁についた液を収集する。ライセート完成。
    • 注)混和がボルテックスで不十分なときは、タッピング、ピペッティングあるいは転倒混和などでよく混ぜてください。ライセート完成後は、速やかに抽出操作を行ってください。
  • 工程⑥
    • ライセートを数回ピペッティングし、カラムに全量添加してください。カラムの蓋をしっかりと閉め、20,000×g( 15,000 rpm )にて1分間遠心させます。遠心機からカラムと廃液容器を注意深く取り出します。廃液が入った容器を捨ててください。
    • 注)試料によっては凝集物ができることがありますが、すべての凝集物ごとカラムへ添加します。遠心後ライセートがカラム内に残っている場合、最高速度で再度遠心操作を行ってください。
  • 工程⑦洗浄
    • 注意深くカラムの蓋を開け、Buffer C8を500µL添加してください。カラムの蓋を開け、20,000×g( 15,000 rpm )にて1分間遠心してください。遠心機からカラムと廃液容器を注意深く取り出します。廃液が入った容器を捨ててください。
    • 注)遠心後 Buffer C8がカラム内に残っている場合、最高速度で再度遠心操作を行ってください。 遠心機からカラムと廃液容器を注意深く取り出してください。廃液が入った容器を捨てます。新しい回収マイクロ遠心チューブに付け替えます。
    • 注)Buffer C8が残余すると回収率が悪くなる場合がありますので注意してください。
    • 注)カラム内部のふちに液が残った場合はキムワイプ等でふき取ってください。
    • 注)洗浄液中のエタノールが溶出液に混入すると、遺伝子増幅反応を阻害します。
  • 工程⑧回収
    • カラムをサンプリングチューブにのせかえます。注意深くカラムの蓋を開け、Buffer D8を100~200µLモノリス表面の中央に添加してください。その後20,000×g(15,000 rpm )で1分間遠心し、溶出する。遠心機からカラムと回収チューブを注意深く取り出し、カラムを捨てます。例えば、200µLで溶出する場合は100µLで2回溶出するとDNAの回収量が増加します。以上で口腔粘膜細胞ゲノムDNAの抽出は完了です。
    • 注)MonoFas®カラムに添加した溶出Buffer D8は、ほぼ全量が回収されます。溶出液量を10µLまで下げられますが、その場合、収量が低下します。

注)回収したゲノムDNAをすぐに使用しない場合は、回収容器のキャップをしっかりと閉めた後、-20℃で保存することをお勧めします。
注)本製品に同封されているBuffer D8以外に、RNase・DNaseフリー滅菌水に置き換えることができます。その場合、pHにより回収率が変動するためアンモニア水や水酸化カリウムなどでpH 8.5~9.0に調整してご使用ください。