技術情報

MonoFas®培養細胞ゲノムDNA抽出キットⅥ プロトコル

必要な試薬及び器具

  • MonoFas培養細胞ゲノムDNA抽出キットⅥ
  • ProteinaseK (10mg/mL)
  • イソプロパノール(特級)
  • 1.5mL遠心チューブ
  • 高速マイクロ遠心機(20,000 × g(15,000 rpm)の遠心が可能なもの)
  • ドライバスと1.5mLチューブ用ヒートブロックまたはウォーターバス(70℃で使用可能なもの)
  • ボルテックスミキサー(2500 rpm 程度の攪拌ができるもの)
  • マイクロピペット、マイクロピペット用チップ

*:遠心機によっては使用できないケースがありますので、遠心機の仕様をご確認の上、使用してください。

培養細胞ゲノムDNA抽出 プロトコル

DNAの抽出

プロトコル詳細及び注意事項

  • 工程①
    • 新鮮培養細胞又は凍結培養細胞を準備してください。培養細胞をPBS所定量200µL中の細胞数は1×107細胞個まで希釈し、Buffer A6を600µL加えてボルテックスミキサーなどで激しく攪拌してください。
    • 注)培養細胞量が多すぎた場合、カラムの目詰まり、回収量減少、精度低下の可能性があります。目詰まりした場合は、細胞量を減らして検討してください。DNAが分解するため、室温で細胞を放置しないでください。
    • 注)凍結細胞を使用する場合は、室温にしてから直ちに Buffer A6を加えてください。新鮮な細胞を使用する場合は、所定量の細胞へBuffer A6を加えてください。70℃にて攪拌しながら、細胞を完全に溶解させます。攪拌しなかった場合、所定量の細胞でも完全に溶解しない場合があります。加温できるシェーカーなどで攪拌してください。または、加温しながら時々ボルテックスして細胞をよく溶解してください。溶解しにくい場合は、加温時間を延長してください。
    • 注)Buffer A6の混和がボルテックスで不十分なときは、タッピング、ピペッティングあるいは転倒混和などでよく混ぜてください。
  • 工程②
    • 70℃で10分間加熱します(インキュベーション)。加温しながら時々ボルテックスして細胞をよく溶解してください。
  • 工程③
    • 特級イソプロパノールを200µL添加し、ボルテックスして混和する。数秒間スピンダウンして、キャップや壁についた液を収集する。ライセート完成後は、速やかに抽出操作を行ってください。
  • 工程④
    • ライセートを数回ピペッティングし、カラムに全量添加してください。カラムの蓋をしっかりと閉め、20,000×g( 15,000 rpm )にて1分間遠心させます。遠心機からカラムと廃液容器を注意深く取り出します。廃液が入った容器を捨ててください。
    • 注)試料によっては凝集物ができることがありますが、すべての凝集物ごとカラムへ添加します。遠心後ライセートがカラム内に残っている場合、最高速度で再度遠心操作を行ってください。
  • 工程⑤洗浄
    • 注意深くカラムの蓋を開け、Buffer B6を500µL添加してください。カラムの蓋をしっかりと閉め、20,000×g( 15,000 rpm )にて1分間遠心してください。遠心機からカラムと廃液容器を注意深く取り出します。廃液が入った容器を捨ててください。
    • 注)遠心後 Buffer B6がカラム内に残っている場合、最高速度で再度遠心操作を行ってください。遠心機からカラムと廃液容器を注意深く取り出してください。廃液が入った容器を捨てます。新しい回収マイクロ遠心チューブに付け替えます。
    • 注)Buffer B6が残余すると回収率が悪くなる場合がありますので注意してください。
    • 注)カラム内部のふちに液が残った場合はキムワイプ等でふき取ってください。
    • 注)洗浄液中のエタノールが溶出液に混入すると、遺伝子増幅反応を阻害します。
  • 工程⑥回収
    • カラムをサンプリングチューブにのせかえます。注意深くカラムの蓋を開け、Buffer C6を20~200µLモノリス表面の中央に添加してください。その後20,000×g(15,000 rpm )で1分間遠心し、溶出する。遠心機からカラムと回収チューブを注意深く取り出し、カラムを捨てます。例えば:200µLで溶出する場合は100µLで2回溶出するとDNAの回収量が増加します。 以上で培養細胞ゲノムDNAの抽出は完了です。
    • 注)MonoFas®カラムに添加した溶出Buffer C6は、ほぼ全量が回収されます。溶出液量を10µLまで下げられますが、その場合、収量が低下します。

注)回収したゲノムDNAをすぐに使用しない場合は、回収容器のキャップをしっかりと閉めた後、-20℃で保存することをお勧めします。
注)本製品に同封されているBuffer C6以外に、RNase・DNaseフリー滅菌水に置き換えることができます。その場合、pHにより回収率が変動するためアンモニア水や水酸化カリウムなどでpH 8.5~9.0に調整してご使用ください。